사이클린의 다중 모드 교란 분석

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 7678(2023) 이 기사 인용

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세포주기 제어는 사이클린 의존성 키나제(CDK)에 의해 수행되며, 암 치료제로서 소분자 약물을 표적으로 하는 CDK에 대한 광범위한 연구에 동기를 부여합니다. 여기서 우리는 조합 CRISPR/Cas9 섭동을 사용하여 CDK 및 관련 요인 간의 기능적 상호 의존성의 광범위한 네트워크를 밝혀내고 43개의 합성 치명적인 상호 작용과 12개의 시너지 상호 작용을 식별합니다. 우리는 단일 세포 RNAseq을 사용하여 CDK 교란을 분석하고 이를 위해 특정 CDK에 의해 조정된 세포 주기 효과와 다양한 세포 상태를 정확하게 정량화하기 위한 새로운 계산 프레임워크를 개발합니다. CDK4/6의 쌍별 파괴는 합성적으로 치명적이지만 정상적인 세포 주기 진행 및 전사 활성화에는 CDK6만 필요합니다. 다중 CDK(CDK1/7/9/12)는 세포 주기 제어와 관계없이 PRMT5와 결합하여 합성 치명적입니다. mRNA 발현 및 스플라이싱 패턴에 대한 심층 분석은 CDK-PRMT5 의존성이 비정상적인 전사 조절로 인해 조기 종료를 초래한다는 여러 줄의 증거를 제공합니다. 이러한 상호 의존성은 약물-약물 시너지 효과로 해석되어 암 및 기타 질병에 대한 치료적 의미를 갖습니다.

세포주기 단계 사이의 조절과 전이는 주로 사이클린 의존성 키나제(CDK) 및 관련 사이클린 단백질에 의해 수행됩니다1. CDK 계열은 20개 이상의 서로 다른 단백질 코딩 유전자를 갖고 있어 규모가 크며, 개별 계열 구성원의 특정 기능에 대해서는 상당한 불확실성이 있습니다1,2. 표준적으로 CDK 단백질은 CDK1, 2, 4, 6과 같이 세포 주기를 조절하는 인자와 CDK7, 9, 121과 같이 전사의 일반적인 제어에 참여하는 인자라는 두 가지 기능적 클래스로 분류됩니다(그림 1a, 확장된 공급 그림 1). 전사 CDK는 개시, 연장 및 종료에 걸쳐 다양한 기능을 통해 RNA 중합효소 II(RNAPII)를 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. CDK7,9 및 12는 모두 RNAPII를 직접 인산화하는 것으로 나타났습니다. 그러나 각 전사 CDK의 기계적 역할과 기능적 중요성에 대해서는 여전히 많은 불확실성이 있습니다. 예를 들어, CDK8(중재자 복합체의 일부로 작동)은 전사 억제인자이자 활성화인자로 보고되었으며, CDK7은 CDK93의 개시, 상한, 프로모터 근위 일시 정지 및 인산화에서 역할을 확립했습니다. CDK9는 전사 신장에 필수적이며, CDK12 녹다운은 특히 긴 유전자와 DNA 손상 반응 유전자 사이에서 전사의 전반적인 손상을 초래합니다1,5,6. 그러나 많은 CDK는 세포 주기와 전사 역할뿐만 아니라 다양한 다른 경로에서도 기능하는 것으로 나타났습니다7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. 예를 들어, 세포 주기 및 전사 클래스 단백질은 모두 후생적 조절인자인 EZH2, AR, PRMT5 및 PARP111,17,18,19,20을 활성화하거나 변환 성장 인자 베타(TGFβ) 경로를 통해 증식성 세포 신호 전달과 상호작용할 수 있습니다21,22 . 새로운 그림은 CDK가 유용하지만 불완전한 지침을 제공하는 "세포 주기" 및 "전사" 라벨을 사용하여 중복되고 시너지적인 기능의 복잡한 네트워크를 관리한다는 것입니다.

삼중 음성 유방암 세포에서 CDK 유전자 기능의 체계적 매핑. (a) CDK 단백질은 세포주기 진행을 제어하고 전사 조절자 역할을 하여 잠재적인 약물 표적(색상)으로 관심을 끌고 있습니다. (b) CDK 합성-치사 및 시너지 상호 작용을 매핑하기 위한 조합 CRISPR/Cas9 적합성 스크리닝 접근 방식을 설명하는 도식입니다. (a)에 나열된 유전자 쌍을 표적으로 하는 이중 sgRNA 구축물의 라이브러리를 올리고뉴클레오티드 풀로 합성하고 렌티바이러스 과발현 벡터에 클로닝했습니다(상단). TNBC 세포주에 이 라이브러리를 코딩하는 바이러스를 형질도입하고 경쟁적 성장 스크리닝을 실시했습니다. 생성된 이중 sgRNA 구성 적합성을 사용하여 단일 유전자 적합도 값을 추출하고 유전적 상호 작용을 매핑했습니다. (c) CDK 유전적 섭동의 기능적 영향을 매핑하기 위한 단일 세포 전사 표현형 접근법을 설명하는 도식. (a)의 유전자를 표적으로 하는 sgRNA 라이브러리를 scRNA-seq 호환 렌티바이러스 과발현 벡터에 클로닝하고 풀 형식으로 TNBC 세포주를 형질도입하는 데 사용했습니다. 형질도입 1주일 후, 10x Chromium 플랫폼을 사용하여 scRNA-seq을 수행했습니다.

100) of unique sgRNA constructs targeting each CDK gene and our computational strategy of imputing single gene fitness effects from the entirety of the combinatorial knockout data ("Methods"). We then analyzed these measurements to identify pairwise gene knockouts in which fitness was significantly less than or greater than expected from the single knockouts50 (Fig. 2b, "Methods"). This analysis identified a collection of 43 synthetic-sick/lethal and 12 synergistic genetic interactions, with CDK1-CDK12 identified as both synthetic-lethal and synergistic depending on context (Fig. 2c,d). These interactions were identified in either of two analysis modes: one treating data from each cell line separately, to identify specific vulnerabilities; another pooling all cell lines as replicates ("pan" cell line, Fig. 2c), to identify interactions occurring consistently across contexts with high statistical power./p> GTTTTGAGACG CGTCTCGTTTG GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA, where the segments and were replaced with the given pair of spacer sequences, and the segment was replaced with a unique random 15-base sequence. The latter was intended to minimize the "uncoupling" of spacer sequences that can arise from abortive PCR products98. To obtain the random 15-base sequences, a pool of 592 barcodes of length 5 bases and minimum Hamming distance of 3 bases was generated using the function DNABarcodes in the Bioconductor package of the same name99. This function was used with the parameter heuristic = "ashlock". A unique permutation of three 5-base barcode sequences was used to define each of the 15-base random sequences. The list of oligonucleotide sequences was submitted to CustomArray, Inc. (Bothell, WA) for synthesis on CMOS array technology./p> GTTTCAGAGCTATGCTGGAAACTGCATAGCAAGTTGAAATAAGGCTAGTCC-3′./p> GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3′./p>

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